Vorlesungsmaterial

vorlesung

Kurzbeschreibungung der Inhalte von 12 Doppelstunden
(Folien werden in Kürze zur Verfügung gestellt)

1. Einführung

  • Vorstellung industrielle Biotechnologie, Geschäftsfelder, -aktivitäten
  • R&D Units
  • Bioökonomie
  • Einsatzfelder der CRISPR als Querschnittstech. in der industriellen Biotechnologie
  • Plattform Genome Editing

– Ziel der Vorlesung

  • Vermittlung der Grundlagen der CRISPR-Systeme bis hin zur Anwendung als Technologie: Studenten sollen zukünftige Entwicklungen eigenständig einordnen, deren Einsatzfelder erkennen und Anwendungen technisch nachvollziehen können:
    • aktuelle Fragestellungen und Forschungsergebnisse im Bereich Genom-Editing und CRISPR zu erfassen und kritisch zu bewerten.
    • eigenständig Lösungsvorschläge zur Editierung von Genen zu entwickeln und entsprechende Experimente zu planen.
    • Wissenschaftliche Ergebnisse in professioneller Form zu präsentieren und zu diskutieren (nach 12 Vorlesungsstunden, werden Studenten im Rahmen eines Minisymposiums ihre Projektarbeiten präsentieren und verteidigen).

– Themenliste

  • Hauptthemen: CRISPR-Biologie, Technologien (mechanistische Beschreibung), Technische Details im Labor

– Von CRISPR zu Genom-Editing und Genregulation

  • Überblick: CRISPR als Immunsystem der Bakterien (grobe Vorstellung des Mechanismus), Cas9 als zentrale Komponente vieler Technologien (“Schweizer Messer der Molekularbiologie”) (kurze Vorstellung der verschiedenen Cas9-Varianten und ihre Anwendungen: Cas9-Nuklease, -Nickase, dCas9, dCas9-VP64…)

 

2. CRISPR-Biologie

– Fremd-DNA Abwehrsysteme von Prokaryoten

  • Exkurs: Restriktions-Modifikationssystem, Abortive Infektion, Toxin-Antitoxin-System, CRISPR (“angeborene” vs. Adaptive Immunabwehrsysteme)

– Bausteine, 3 Phasen, Nomenklatur / Klassifizierung

  • CRISPR Komponenten / erste Beschreibung der Repeats / Bioinform. Vorhersagen
  • Nomenklatur: Def. Spacer, Protospacer, Protospacer adjacent motif (PAM), Cas proteins
  • Klassifizierung: 3 Hauptypen und 12 Subtypen, Charakteristika, Verteilung in Bakterien / Archeen

– Mechanismen der 3 Phasen

  • Adaptationsphase: Spacer Auswahl, Generierung, Integration (polarer Aufbau der CRISPR-Kassetten), Cas1 / Cas2, Cas1-Reverse-Transkriptase, Rolle der Leadersequenz
  • Prozessierungsphase: Transkription, Leader, Regulation, precursor crRNA, Prozessierung, mechanistische Unterschiede der 3 Haupttypen
  • Interferezphase (Verständnis hier wichtig, um die Technologie optimal zu verwenden): Protospacer Identifizierung, seed-Sequenz, R-loop-Ausbildung (was ist R-loop, D-loop, andere Bsp.), Ziel-DNA Inaktivierung: Doppelstrangbrüche vs. Exonukleolytischer Abbau

– 3 Haupttypen: Struktur/Funktion der Effektorkomplexe

  • Cascade-Komplex
  • Cas9
  • Csm/Cmr
  • Strukturen / Besonderheiten

– Autoimmunität

  • Aktive Mechanismen zur Kontrolle der Autoimmunität
  • Passiv über Selektion als SOS-response?

– Erste Anwendungen der CRISPR-Systeme in Bakterien

  • Phagen-resistente Stämme als Starterkulturen
  • Regulation der Genexpression mit Cascade-Komplexen
  • Degradierung von mRNAs mit Cmr-Systemen

– Zusammenfassung und Viren mit eigenen CRISPR-Systemen

 

3. Typ II-Systeme in der Anwendung

– Komponenten

  • Cas9 Proteine und dazugehörige PAMs (SpyCas9, StaCas9, NmCas9; Vor- und Nachteile der verschiedenen Cas9-Proteine; Stichwort: A-rich targets, PAMs)
  • Programmierung der Cas9-Bindestelle: 3 Komponenten System (Cas9, crRNA, tracrRNA) vs. synthetisches 2 Komponenten System (Cas9, sgRNA) (Vor- und Nachteile der beiden Systeme; Stichwort: RNase III Prozessierungs-Abhängigkeit aber multiplexing vs. gut charakterisierte Promotoren mit klar definierten Transkriptionsstartstellen)
  • Exkurs: Promotoren (prok. / eukar.), RNAP II vs. RNAP III-abhängige Promotoren in Euk.; co-transkriptionelle capping an RNAP II-abhängigen Promotoren à Problem für sgRNA
  • Exkurs: Ribozyme; Hammerhead, HDV à Ribozym-abhängige Freisetzung von sgRNAs in euk. Organismen für die keine RNAP III-abhängige Promotoren gut charakterisiert sind
  • Promotoren zur Expression in Prok. / Eukar. (reguliert vs. konstitutiv); Regulation auf der Ebene der Cas9-Aktivität: Licht- bzw. small molecule induzierte Cas9-Dimerisierung; split-Cas9 complex

– Zusammenfassung / Ausblick

 

4. Genome-Editing

– Definition Genome-Editing

  • Editing vs. Engineering (Stichwort: Editing in der Informatik)

– Genetic Engineering Bakterien vs. Eukaryoten / humane Zellen

  • Bakterien: Restriktionsendonukleasen, Cre/LoxP; FRT/Flp, Selektion / Gegenselektion bsp. ura3, yeast cloning
  • Eukaryoten / Mäuse: Nobelpreis für Physiologie/ Medizin 2007 an Martin Evans, Mario Capecchi und Oliver Smithies; kurz Prinzip der HR-vermittelten Mutagenese
  • Exkurs: Reparaturmechanismen in der Zelle (NHEJ / Homologe Rekombination)

– Vergleich TALEN, Zn-finger, Meganukleasen / Cas9

  • Programmierbare Nukleasen
  • Protein-basiert vs. RNA-basiert
  • Technische und zeitliche Unterschiede/ Kosten (“Demokratisierung” der Genom-Editing)
  • Wichtig: Mutliplexing mit Cas9
  • Problem: Off-targets; Lösungen, die bereits da sind (high-fidelity Cas9, kürzere sgRNAs …)

– Anwendungen: wann NHEJ, wann Deletion, wann HR

  • NHEJ -> Knock-out (Proteine / microRNAs)
  • Deletion -> Knock-out + regulatorische Regionen + Genom-Reduzierung
  • HR -> Knock-out + Insertion (Knock-in) + Punkt-Mutationen + Sequenzkorrektur

– Bsp. aus der weißen, grünen, roten Biotechnologie

– Zusammenfassung / Ausblick

 

5. Technische Details der Anwendung

– Aufbau von Vektoren, Komponenten

  • Human: CMV für Cas9 – nuclear localization sequence (alternativen)
  • Anreicherung von transfizierten / transduzierten Zellen (gekoppelt an Cas9-Expression über 2A-Linker); kurzes Exkurs: Herkunft und funktionsweise von 2A-Peptid-Linkern, Anwendung für Erstellung von multi-cistronische Operons in Eukaryoten
  • U6 Promotor für sgRNAs (alternativen)

– Design sgRNAs (Regeln), Online-Tools, Datenbanken

  • Onlinetools, Datenbanken, off-target Reduzierung, GC-Gehalt, …

– Klonierungsmöglichkeiten: TypIIS, Gibson, Golden Gate

  • TypIIS Enzyme (BbsI, BsmBI, BsaI …), Generierung von Spacersequenzen durch Hybridisierung, alternativen Gibson, Golden Gate cloning

– Transformation, Konjugation, Transfektion, Elektroporation, Transduktion, RNP Elektroporation / Transfektion

  • Vorstellung der verschiedenen Delivery-Methoden: Standard: Transformation, Konjugation (Bakterien), Transfektion, Elektroporation, Transduktion (Adenoviren, Lentiviren); Exkurs: Viren, integrativ vs. nicht-integrativ; spezielle Methoden: Delivery von Ribonukleoprotein-Komplexen (NLS-Cas9 in vitro mit sgRNA beladen à Lipid-vermittelte Transfektion …); in vitro Transkription von sgRNAs

– Analyse der Editierung (Methoden; Surveyor / TIDE Analyse)

  • Surveyor / T7E1 Nukleasen: Indel-Mapping (quantitativ)
  • TIDE: Tracking of Indels by Decomposition; Vorführung eines Beispiels mit Orginaldaten
  • Vor- und Nachteile beider Methoden
  • Nachweis knock-in´s
  • Nachweis auf Protein-Ebene

– Zusammenfassung / Ausblick

 

6. Genregulation (CRISPa, CRISPRi, Epigenetik)

– CRISPRi

  • Dead-Cas9; Inhibierung der Transkription, Blockierung des Promotors, coding vs. non-coding strand, mutiplex, Euk.: dCas9-KRAB

– CRISPRa

  • Aktivierung der Transkription, Rekrutierung der RNAP, Fusion dCas9 zu w-Untereinheit der bakteriellen RNAP, Euk.: dCas9-VP64, Definition Promotor Prok. / Euk., wie bei euk. Zielgenen vorgehen, wenn Promotoren nicht klar definiert sind; Online-Tools, Datenbanken

– CRISPRa / CRISPRi: Vergleich klassisch / Aptamer-basiert

  • Klassisch: Fusion von dCas9 zu Aktivatoren / Repressoren
  • Rekrutierung der Faktoren über sgRNA-Varianten (Protein-bindende RNA-Aptamere)
  • Exkurs: Aptamere, Aptamervarianten

– Orthogonal / Multiplex

  • Multiplex mit verschiedenen Cas9-Proteinen, multiplex über sgRNA-Varianten

– Epigenetik

  • Exkurs Epigenetik
  • Modulation Histon-Modifikation durch dCas9-p300 Fusion

– Anwendungsbsp. aus der Literatur und aus der Industrie

 

7. Genome-wide screenings

– Prinzip

  • Untersuchung Phänotyp <-> Genotyp (Vorwärts-, Rückwärtsgenetik)
  • Definition sgRNA-Libraries
  • Anwendungsfelder: Target-Identifizierung / -Validierung
  • Analyse Signalwege (Bsp.: Aufbau eines Expressions-Reportersystems und Identifizierung der Gene, die an der Expression beteiligt sind)
  • Notwendigkeit von Lentiviren
  • Versuchsablauf: Transduktion / Selektion / Anreicherung / Identifizierung

– Loss-of-function / gain-of-function Screenings

– Library-Typen

  • Pooled vs. focussed library

– Aufbau eines eigenen Libraries; Custom Arrays

  • 65000 sgRNA Library, vorgehen, Amplifikation, Klonierung, Repräsentativität

– Problem des Read-outs

– Anwendungsbsp. aus der Literatur / Zusammenfassung

 

8. Weitere Anwendungen / Anwendungen anderer Cas-Proteine, CRISPR-Systeme

– GPS, Protein-Protein Interaktion / Protein-RNA-Interaktion

  • Lokalisation von DNA-Stellen in vivo
  • Protein tagging in vivo – Cas9 Applikation
  • Protein-RNA-Interaktion – Csy4-System

– PAMer

  • Erste Ansätze zu Abbau von mRNA mit Cas9

– DNAi – Kill switch

  • Programmierter Abbau von Ziel-DNA bzw. Zelltod in Bakterien, mögliche Anwendungen in der Industrie

– Anti-bakteriell

  • Phagentherapie, Phagen mit CRISPR, alternative für multiresistente Keime – Unternehmen, die CRISPR-basierte antimikrobielle Systeme entwickeln

– Genetic Engineering von Phagen mit Cascade

– Viren mit eigenen CRISPR-Systemen

 

9. Anwendungsbeispiele in  Industriellen Biotechnologie 

– Humane Zellen

  • Generierung Modell-/Screening-Zelllinien
  • Target- Identifizierung / Validierung
  • Bsp. Zellmodellsysteme

– Hefen

  • Pathway engineering
  • Stammoptimierung

– Prokaryoten

  • Homologe Rekombination, Fehlen von NHEJ und mögliche Auswege
  • Stammoptimierung

 

10. Gene Drive

– Was ist Gene Drive

  • Theorie: selfish-genes für Gene Drive von Austin Burt
  • Exkurs: Mendelsche Regeln und “Ausdünnung” von freigesetzten Genmutationen in der Natur

– Mutagenic chain reaction

  • “Aushebeln” der Mendelschen Regeln
  • Sehr hohe Gene Drive Effizienz im Labor: Bsp. Drosophila, Anopheles, Saccharomyces

– Nutzen vs. Gefahren

 

11. Rückblick / Ausblick

– Zusammenfassung der behandelten Themen / Techniken

– Aktuelle Entwicklungen

 

12. Fragen, Diskussion, Ethische Aspekte, Patentstreitigkeit

– Regulation / Sichtweise der Behörden und Gutachter zu CRISPR-Technologie

  • GMO / non-GMO Diskussion
  • Regulation in Deutschland, Regulation auf EU-Ebene
  • Widersprüchliche Gutachten: führt CRISPR-Technologie zu GMOs oder non-GMOs
    • Stellungnahme Leopoldina / DFG zum Thema CRISPR
    • Stellungnahme BVL – CRISPR keine Gentechnik
    • Rechtsgutachten Prof. Spranger
  • Vergleich akzeptierte, traditionelle Mutagenese-Verfahren (chemische / physikalische) und zielgerichtete Mutagenese (ODM, CRISPR); Vor- und Nachteile

– Keimbahn vs. Somatische Gentherapie

– Gene Drive

–  Patentproblem / -Rechtsstreit

 

Themen für das Minisymposium

Bearbeitung von experimentellen Lösungen aus den Bereichen

  • Ausknocken des prp-Gens (Prion-Krankheit)
  • Knock-out in Prokaryoten
  • Genaktivierung / Multiplex (CRISPRa)
  • Geninhibierung / Multiplex (CRISPRi)
  • Epigenetik
  • Ansätze zu Gentherapie
  • Schutz gegen virale Integration – Bsp. HIV
  • Gene Drive
  • Genome-wide screenings
  • Zusammenstellung der Organismen, die bisher mit CRISPR-Technologie modifiziert wurden

www.crispr.de